Bestimmte Umweltbedingungen bewirken Unschärfen bei der Quantifizierung des Abbaus.

Einschränkungen im quantitativen in situ-Nachweis des biologischen Schadstoffabbaus mittels stabiler Isotopenfraktionierung (SIFA) ergeben sich neben messtechnischen Limitationen durch mehrere Faktoren. Grundsätzlich gilt jedoch, dass eine Isotopenfraktionierung >1‰ ein qualitativ hinreichender Nachweis für einen Schadstoffabbau ist. Für eine quantitative Bewertung müssen die genaueren Umstände der Schadstofffreisetzung und des Grundwassertransports bekannt sein.

Parallele physikalische Prozesse wie Sorption und Evaporation beeinflussen den Isotopengehalt einer Substanz zusätzlich zur biologischen Fraktionierung. Diese Veränderungen sind jedoch bei den genauer untersuchten Schadstoffgruppen (BTEX, PAK, PCE, MTBE) um 1-2 Größenordnungen geringer als biologische Effekte. Dennoch verursachen Huminstoffe (als Adsorptionsmatrix) oder eine geringe Wassersättigung (als Evaporationsraum) Unschärfen bei der quantitativen Abschätzung des biologischen Abbaus.

Parallele chemische Abbauprozesse können eine erhebliche Fraktionierung zur Folge haben (z.B. bei der chemischen Reduktion chlorierter Ethene durch Fe0, die bei reinigenden Grundwasserbarrieren angewendet wird). Insofern spiegelt eine signifikante Isotopenfraktionierung nicht zwingend einen biologischen Abbau wider, ihr Nachweis ist aber ebenso eine Erfolgskontrolle für chemischen Abbau.

Unterschiedliche Redoxbedingungen (d. i. die Verfügbarkeit von Elektronenakzeptoren wie O2, NO3, SO4, FeIII, HCO3) aktivieren in den abbauenden Mikroorganismen oft unterschiedliche Enzymsysteme. Unter oxischen Bedingungen werden z. B. häufig Dioxygenasen aktiviert, die zu einer geringen Isotopenfraktionierung von 13C führen, während unter anoxischen Bedingungen meist stark fraktionierende Monooxygenasen zum Schadstoffabbau dienen. In heterogenen und oxischen Bodenzonen, in denen die Redoxbedingungen wechseln, kann die Abbauleistung der Mikroorganismen daher relativ unabhängig von der Isotopenfraktionierung sein.

Die Abfolge oder die Mischung von verschiedenen Isotopenspezies desselben Schadstoffs erschwert die Interpretation einer Isotopenfraktionierung. Eine Maskierung der biologischen Prozesse ergibt sich z. B. wenn bei der Kontamination sukzessive verschiedene Isotopenspezies eines Schadstoffes freigesetzt wurden. Dies kann der Fall sein, wenn ein undichter Tank mit Toluol unterschiedlicher geographischer Herkunft (und daher mit unterschiedlichem Isotopengehalt) befüllt wurde.

Die Mischung von zwei Isotopenspezies eines Schadstoffes ergibt sich bei einer Mehrfachkontaminierung, wenn der Schadstoff sowohl Kontaminante als auch Abbauprodukt ist. Bei einer Vierfachkontaminierung mit chlorierten Ethenen (PCE-TCE-DCE-VC), die zugleich sukzessive dehalogeniert werden, sind deshalb für die letzteren drei Schadstoffe nur qualitative Aussagen zum biologischen Abbau möglich.